IPS诱导肠类器官的培养过程可分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导、以及类器官的培养。本文将首先介绍第一阶段——人多能干细胞的培养。

一、实验准备

1. 人多能干细胞培养基的配制：

（1）在2-8℃条件下解冻hPSCMediumSupplement，轻轻摇匀后按实际需求分装，建议立即使用或储存于-20~-80℃，以避免反复冻融。

（2）按1:50的比例将10mL hPSCMediumSupplement加入500mL hPSCMediumBasalMedium中，充分混合，得到人多能干细胞培养基（abs9403）。注意：混合后的人多能干细胞培养基可在2-8℃储存2-3周，但不建议使用超过3周的培养基。

（3）实验试剂平衡：人多能干细胞培养基在实验前需在室温下避光平衡，PBS、消化液等需加热至37℃。注意，培养基中含有因子，不可使用37℃水浴加热。

二、操作方法（无菌条件下进行）

hPSC细胞复苏：

1. 实验操作步骤：

（1）基质胶包被培养板：取出6孔或12孔板，每孔加入1mL或0.5mL基质胶（abs9410），轻轻摇动使其完全覆盖皿底，放入37℃培养箱中孵育1-2小时。实验前将其移至超净工作台或生物安全柜中，在室温下平衡20分钟。如暂不使用，可用Parafilm封口后于2-8℃储存，并在1周内使用。

注意：一支冻存的干细胞数量约为1×10⁶ cells/mL，适合6孔板的一个孔；即用型基质胶对温度敏感，使用后应立即放回4℃冰箱保存，不可用手直接触碰基质胶液面所及的瓶身，以免影响质量。

（2）准备2-3mL的干细胞培养基于15mL离心管中备用。

（3）解冻：将冻存管快速浸入37℃温水中，快速摇动使其在1-2分钟内完全解冻，注意要迅速减少细胞暴露在室温中的时间。

（4）离心：将冻存管中的解冻液逐滴加入含有干细胞培养基的15mL离心管中，平衡后以1000rpm离心3分钟。

（5）重悬：离心后弃上清，加入1mL人多能干细胞培养基对细胞沉淀进行轻柔的吹吸混匀，重复3-5次。

（6）接种：将均匀的干细胞悬液加入已包被的6孔板，每孔补全至2mL培养体系。

（7）培养：接种后的6孔板置于倒置相差显微镜下观察细胞密度及团块大小，理想为4个细胞以上的团块，轻轻晃动6孔板以使细胞均匀分布，并置于37℃、5% CO₂的恒温培养箱中培养，第二天观察细胞贴壁情况。

（8）换液：从复苏开始每24小时更换一次培养基，因为培养基中的活性成分只能维持一天，需及时更换新鲜培养基。

多能干细胞（PSCs）传代

2. 实验具体操作步骤：

（1）清洗：吸掉原有培养基，缓慢加入1mL PBS缓冲液并轻轻摇动，然后沿培养皿边缘吸去PBS。

（2）消化：在6孔板中加入2mL/孔人多能干细胞消化液（abs9409），覆盖皿底，并置于37℃培养箱中2-5分钟，消化时间需根据细胞密度调整，一般建议2-5分钟。

（3）吹打：吸掉消化液后，加入2mL人多能干细胞培养基，轻柔地在培养皿底部进行3-5次扇形吹打，使细胞从皿底脱落并转移至15mL离心管中。注意，吹吸细胞的力度要轻柔，尽量避免形成单细胞。

（4）离心：以1000rpm离心3分钟，弃上清。

（5）接种：用人多能干细胞培养基再次轻轻吹打细胞，吸掉包被培养板中的基质胶，加入细胞悬液并补全每孔至2mL的培养体系。

（6）换液：从传代开始，每24小时换液一次，确保新鲜培养基的及时更换。

多能干细胞（PSCs）冻存

3. 实验具体操作步骤：

（1）清洗：同上步骤（21）。

（2）消化：同上步骤（22）。

（3）吹打：同上步骤（23）。

（4）离心：同上步骤（24）。

（5）重悬：弃上清后，加入2mL ES/iPS细胞冻存液（abs9412），对细胞沉淀进行轻柔吹吸混匀，并将其转移到冻存管中。

（6）记录：在冻存管上标记细胞种类、时间、操作者及细胞批次。

（7）冻存步骤：将冻存管置于-80℃冰箱中过夜，注意保持冻存管直立，避免倾斜或横放；24小时后转移至液氮中进行长期冻存。

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