## 一、原理概述

Western Blot技术的基本原理与Southern或Northern杂交技术相似，但采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测对象为蛋白质。该方法使用抗体作为“探针”，通过标记的二抗进行显色。经过PAGE分离的蛋白质样品，会被转移到固相载体（如硝酸纤维素膜）上，固相载体通过非共价键形式吸附蛋白质，并能保持其生物活性和电泳分离的多肽类型不变。随后，固相载体上的蛋白质作为抗原与相应的抗体发生免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体反应，通过底物显色或放射自显影来检测目标蛋白的表达。这项技术广泛应用于蛋白质表达水平的检测，既可以进行定性分析，也能半定量，所以Western Blot成为初步鉴定蛋白质的最便捷与通用的方法。在显色方法上，常见的有以下几种：i.放射自显影，ii.底物化学发光ECL，iii.底物荧光ECF，iv.底物DAB显色。其中，底物化学发光ECL和底物DAB显色是最常用的选择，尤其是在实验条件相同的情况下，ECL法更为流行。通过简单的操作与现成的试剂盒，即可实现该方法，通过原理如下。

反应底物为过氧化物+鲁米诺，遇到HRP后产生发光，使得胶片曝光，并洗出条带。

## 二、操作步骤

### (一) 配胶

1. 确保玻璃板彻底清洁，并用去离子水冲洗，干燥后将与胶接触的一面朝下放置在干净纸巾上。分离胶及浓缩胶可提前配制（除AP及TEMED外），过滤后避光储存于4°C，至少可存放一个月。使用前需室温平衡。

2. 封胶：在灌入分离胶后立即封胶，确保胶浓度与SDS比例相符。必须等待胶凝后再倒掉封胶液，并用清水与去离子水彻底冲洗以去除残留物。

### (二) 样品处理

1. 对于培养细胞：冲洗后用1×loading buffer处理细胞，经过156°C煮沸及Vortex处理后进行样品分析。

2. 组织样本处理：取50~100mg组织加1ml裂解液，保持低温进行匀浆与离心，收集上清液进行后续分析。确保最终样品浓度均匀，并使用loading buffer上样。

### (三) 电泳

在上样前确保去除气泡，样品准备后在初始电压下进行稳流电泳，随之改为稳压电泳，直到目标蛋白达到预定距离。

### (四) 转膜

在电泳结束前准备转移液，将NC膜进行适当处理后，与胶片共同转移，确保膜和胶的接触良好，进行电转或者干转。

### (五) 封闭及杂交

将膜在封闭液中稍加搅拌，使其充分封闭，再进行一抗孵育，最后进行二抗标记，并用PBST或TTBS洗涤膜。

### (六) 发光鉴定

使用辣根过氧化物酶HRP-ECL或碱性磷酸酶法进行显色，按照指示操作以获取最终结果。

## 三、注意事项与品牌提示

在操作过程中，若观察到目标条带不明显，可尝试延长显影时间或更换洗涤液，以增强信号。对于使用的抗体，确保高质量以降低非特异性条带的出现。

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