人生就是博-尊龙凯时的mRNA技术作为一种前沿的生物科技，展现出了巨大的应用潜力。从mRNA疫苗到mRNA药物，这项技术为疾病的预防与治疗开辟了新的路径。然而，mRNA技术的发展并不平坦，其中最大困难之一便是副产物双链RNA（dsRNA）的生成。dsRNA作为一种免疫刺激分子，能够引发机体的免疫反应，这对mRNA的安全性和有效性产生了负面影响。因此，如何减少dsRNA的产生，已成为mRNA技术领域亟需解决的关键问题。

传统的方法通常依赖复杂的纯化工艺，但这往往成本高、效率低，并且难以彻底清除微量的dsRNA。作为mRNA体外转录（IVT）的核心工具，T7RNA聚合酶（T7RNAP）的天然活性（包括末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性）被认为是dsRNA形成的重要因素。因此，如何借助定向进化或理性设计来改造T7RNAP，已成为全球科研团队的研究重点。

在2024年3月3日，我们团队在FEBS Journal发表了题为“Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities”的研究论文。我们通过工程化改造T7RNAP，显著降低了体外转录过程中dsRNA的产生（仅为野生型的18%），同时大幅提升了合成mRNA的整体效率和质量，从而促进了基因治疗和疫苗开发等领域的跨越式进展。

我们创新性地结合了定向进化和半理性设计的方法，成功筛选出了多个高效低毒的T7RNAP突变体，这些突变体在减少dsRNA生成方面表现出色。通过构建随机突变库，我们设计了一种实时监测液滴内RNA产物完整性及dsRNA含量的分子信标探针系统，并运用荧光激活液滴分选（FADS）技术进行高通量筛选。最终筛选出的关键候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T）在dsRNA含量方面显著低于野生型。

此外，通过半理性设计，我们构建了十个单点饱和突变库，并应用微孔板筛选法识别有益突变体。在筛选超过1000个突变体后，确定了Mut11（K180E）和Mut14（A70Q）为关键候选突变体，这两个突变体在生成dsRNA方面均低于野生型，并未影响转录效率。

为进一步优化，我们针对上述突变位点构建了DNA重组文库并通过微孔板筛选，最终获得组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E）。实验结果显示，M17的dsRNA含量仅为野生型的18%，在筛选体系中仅为0.007 ng/μg。这一结果不仅在体外实验中得到了验证，在细胞实验中也显示出显著的免疫原性降低和蛋白翻译效率提升。我们将这些突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞后，最佳突变体M11产物引发的干扰素β（IFN-β）mRNA和蛋白的表达量分别为野生型的97%和1293 pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达细胞数显著增加，且荧光强度稳定。这表明，通过减少dsRNA，能够有效解除PKR介导的翻译抑制，从而释放mRNA的治疗潜力。

为了深入理解突变体降低dsRNA的机制，我们通过计算机模拟与功能实验揭示，突变体的dsRNA生成降低是由于RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端转移酶活性的降低。这一发现为未来进一步优化T7RNAP提供了重要的理论基础。

本研究为T7RNAP的改造开辟了新的方法与思路，同时也为mRNA技术的发展注入了新的活力。通过减少dsRNA的产生，提高了mRNA的质量和安全性。凭借此项研究成果，我们成功推出了一款大幅降低dsRNA含量的GMP级别T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7 RNA polymerase GMP-grade (low dsRNA, 250 U/μL)）。该产品在mRNA疫苗、mRNA药物等领域展现出广泛的应用潜力，有望进一步推动mRNA技术的蓬勃发展，为生物医学领域带来更多可能性。

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